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注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。
組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
Sodium oxalate芐基苯基硫 98%FMOC-D-炔基甘氨酸 96%

Sodium sulfide3-溴硫代苯甲 98%Fmoc-D-烯基甘氨酸 96%

Sodium aluminate2-溴茴香硫 98%FMOC-D-3-(4-吡啶基)-氨酸 98%

Sodium antimonate4-溴茴香硫 98%FMOC-L-3-(3-吡啶基)-氨酸 98%

Sodium bismuthate3-溴甲基-5-氯苯并噻吩 98%FMOC-L-3-(2-吡啶基)-氨酸 97%

Sodium carbonate decahydrate5-溴噻吩-2-甲 97%FMOC-D-3-(2-吡啶基)-氨酸 98%

Sodium chromate5-溴苯并[b]噻吩 98%FMOC-L-4-氨酸 98%

Sodium chromate tetrahydrate2-溴 99%FMOC-D-4-氨酸 98%

Sodium fluoroaluminate4-溴正苯 99%FMOC-L-3-氨酸 98%

Sodium fluoroborate2-溴-4-氯苯甲 98%FMOC-D-3-氨酸 98%

Sodium hexametaphoshpate3-溴苯甲酰氯 98%FMOC-L-2-氨酸 97%

Sodium polyphosphate3-溴乙基苯 98%FMOC-D-2-氨酸 98%

Sodium hypophosphite4-溴乙基苯 99%FMOC-L-4-溴苯氨酸 98%

Sodium metaborate tetrahydrate4-甲氧基-α－溴代苯乙酮 98%FMOC-L-2-溴苯氨酸 98%

Sodium metaphosphate3-溴噻吩 97%FMOC-L-3,4-二氯苯氨酸 96%

Trisodium trimetaphosphate2-溴-3-甲基噻吩 99%FMOC-D-3,4-二氯苯氨酸 96%

1,2,3,5-四氯苯(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-Myosin Light Chain 2 (Thr18/Ser19) AntibodyLRRC4B/NGL3  神經(jīng)突觸蛋白NGL3抗體

氟苯脲(分析標(biāo)準(zhǔn)品,98%(HPLC))Phospho-Myosin Light Chain 2 (Ser19) Mouse mAbLRRC41  LRRC41蛋白抗體

氟苯脲(分析標(biāo)準(zhǔn)品,99%(HPLC))Phospho-Myosin Light Chain 2 (Ser19) Mouse mAbLRRC4  腦瘤相關(guān)基因抗體

1,2,3-三氯苯(分析標(biāo)準(zhǔn)品,>99.8%（GC))Acetyl-CoA Carboxylase (C83B10) Rabbit mAbLRRC2  LRRC2蛋白抗體

1,2,4,5-四氯苯標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.104mg/ml,基體:異辛烷)Acetyl-CoA Carboxylase (C83B10) Rabbit mAbLRRC15  富含亮氨酸重復(fù)蛋白15抗體

標(biāo)準(zhǔn)溶液(202mg/L,基體:甲)PhosphoPlus® RIP (Ser166) Antibody DuetLRRC10  富含亮氨酸重復(fù)蛋白10抗體

標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/ml,u=4%)Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAbLRPAP1/MRAP  脂蛋白受體相關(guān)蛋白抗體（低密度脂蛋白相關(guān)蛋白的相關(guān)蛋白1）

標(biāo)準(zhǔn)溶液(10μg/ml,u=7%)MSK2 (D41A4) XP® Rabbit mAbLRP6  低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6抗體

三唑磷(分析標(biāo)準(zhǔn)品,>97%(HPLC))Histone H3 (96C10) Mouse mAb (IHC Formulated)LRP5  低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5抗體

蟲(chóng)酰肼(分析標(biāo)準(zhǔn)品,99%)MST1 AntibodyLrp2/Megalin  糖蛋白gp330抗體
伯氏疏螺旋體PCR檢測(cè)試劑盒廠家埃茲蛋白抗體Acetophene tosylhydrazone中文名：苯乙酮對(duì)甲苯磺?；陝e名：分子式：C15H16N2O2S

轉(zhuǎn)錄因子E2F-4抗體2-Ami-4-chlorobenzothiazole中文名：2-氨基-4-氯苯并噻唑別名：分子式：C7H5ClN2S

細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子ELK1抗體Allyl phexyacetate中文名：苯氧乙酸烯丙酯別名：分子式：C11H12O3

內(nèi)皮素-1單克隆抗體2-Allylphel中文名：2-烯丙基酚別名：分子式：C9H10O

腸道病毒71型抗體2-Ami-2'-chloro-5-nitro benzophene中文名：2-氨基-5-硝基-2'-氯二苯甲酮?jiǎng)e名：分子式：C13H9ClN2O3