?
注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。
組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?，分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
四二二甲(standard for GC,≥99.5%(GC))SHIP2 Antibody二-1,2-二硫環(huán)戊酮

蒽(分析標(biāo)準(zhǔn)品,≥99.7%)Phospho-Lyn (Tyr507) AntibodyN-甲基-2-吡咯甲

茴香(分析標(biāo)準(zhǔn)品,>99%(GC))Phospho-Lyn (Tyr507) Antibody甲基-2-環(huán)己-1-酮

三叔丁(標(biāo)準(zhǔn)品)Lyn Antibody鹽酸達(dá)波西汀

間甲酚(標(biāo)準(zhǔn)品)XRCC1 Antibody2-吡咯甲酸甲酯

并(b)熒蒽標(biāo)準(zhǔn)溶液(5μg/mL,基體：甲)Fes Antibody奎寧環(huán)酮鹽酸鹽

并(k)熒蒽標(biāo)準(zhǔn)溶液(4.38ug/ml,基體:甲)ATRIP Antibody[5-(二甲基氨?；?哌啶-基]硫]-6-(1-羥基)-甲基-7-氧代-1-氮雜二環(huán)[3.2.0]庚-2--2-甲酸

溴-(標(biāo)準(zhǔn)品)ATRIP Antibody2-羥基喹喔啉

溴-(98%)MGMT Antibody5-吲哚甲

丁基羥基茴香(BHA)(分析標(biāo)準(zhǔn)品,>99%(GC))NEDD4 Antibody氨甲環(huán)酸

2,丁二酮(標(biāo)準(zhǔn)品,≥99.0%(GC))Phospho-MARCKS (Ser152/156) Antibody1-氨基-2-萘酚鹽酸鹽

甲基叔丁基(分析標(biāo)準(zhǔn)品,>99.95%(GC))Rat (LTF-2) mAb IgG2b Isotype Control (PE Conjuga)氫化肉桂酸內(nèi)酯

溴酸(標(biāo)準(zhǔn)品)BLM Antibody4,4'-二氨基-3,3'-二甲基聯(lián)

(標(biāo)準(zhǔn)品)ISG15 Antibody(2-AMINO-ETHYL)-BENZOIC ACID

標(biāo)準(zhǔn)溶液(506ug/ml,溶劑:甲)CD8α (RPA-T8) Mouse mAb (PE-Cy7® Conjuga)鎳鋁合金(1:1)

正丁基(分析標(biāo)準(zhǔn)品,≥99.8%(GC))SPINK3 Antibody氨基-2,5-二氟酚

酸丁酯（BA）(分析標(biāo)準(zhǔn)品,>99.5%(GC))NEDD8 Antibody化基鈀(II)二聚物

對(duì)溴酚(標(biāo)準(zhǔn)品)FEN-1 Antibody羧基-氟酸

犬甘油-3-酸脫氫酶(GAPDH)ELISA試劑盒NOS-3/eNOS  一氧化氮合成酶-3（內(nèi)皮型）300 ul

犬干擾素誘導(dǎo)蛋白10(IP-10/CXCL10)ELISA試劑盒Phospho-eNOS (Ser1177)  酸化一氧化氮合成酶3（內(nèi)皮型）100 ul

犬泛素蛋白(Ub)ELISA試劑盒Phospho-eNOS (Ser113)  酸化一氧化氮合成酶3（內(nèi)皮型）100 ul

犬兒茶酚抑素(CAT)ELISA試劑盒Phospho-eNOS (Thr495)  酸化一氧化氮合成酶3（內(nèi)皮型）300 ul

犬多肽YY(PYY)ELISA試劑盒Nitric oxide/NO  一氧化氮100 ul

犬膽囊收縮素/縮膽囊素八肽(CCK-8)ELISA試劑盒Notch1/MOTC  跨膜受體蛋白Notch-1300 ul

犬催素(PRL/LTH)ELISA試劑盒Notch3  跨膜受體蛋白Notch-3100 ul

犬促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)ELISA試劑盒Nox-4/NADH  NADPH氧化酶420 ul

犬促腎上皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)ELISA試劑盒NADPH  還原型輔酶Ⅱ300 ul
鴨肝炎病毒PCR檢測(cè)試劑盒廠家DNA聚合酶μ/DNA pol μ抗體3-O-Acetylolealic acid中文名：齊墩果酸乙酸酯別名：Olealic acid acetate分子式：C32H50O4

細(xì)胞周期蛋白3抗體Epifriedelal acetate中文名：別名：分子式：C32H54O2

DNAJC9蛋白抗體14,17-Epidioxy-28-r-15-taraxerene-2,3-diol中文名：別名：Baccatin分子式：C29H46O4

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶2抗體2-Epitormentic acid中文名：2-表委陵菜酸別名：分子式：C30H48O5

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3L抗體21-Episerratriol中文名：別名：3-Epilycoclaval分子式：C30H50O3